生物學實驗室檢測安裝驗證

生物制品質量控制中采用的方法包括理化分析方法和生物學測定方法，其中理化分析方法的驗證原則與化學制品基本相同，具體驗證時還需結合生物制品的特點考慮。生物學測定系指采用生物學方法，以反映被測物的生物學特性為目的的測定方法。

（1）生物學測定常用方法

生物學測定方法可廣泛用于各種檢測目的，包括鑒別、生物活性和雜質檢測等，其中最主要的是生物活性（或效價、效力）測定，生物制品質量控制中經常采用的方法如下。

①以整體動物為試驗材料檢測制品生物活性（或效力）的動物試驗，一般用于成品檢定。如動物保護力試驗，用于疫苗的效力測定。

②在細胞水平上測定產品的生物活性的細胞測定試驗。常用于各種生物制品的活性(效力)測定。這類方法的變異較大。

③利用酶反應速率或免疫相互作用誘導的生物反應等方法測定生物活性的生化檢測方法。這類方法的變異相對較小,結果比較準確。

（2）生物學檢測方法驗證的范圍

一般情況下，需驗證的分析項目有:鑒別試驗、純度和雜質檢查、原液或制劑中有效成分的含量測定及生物活性測定。其他質控方法，如必要時也應加以驗證。

（3）生物學檢測方法驗證文件的建立

生物學測定方法驗證方案中應包括驗證用樣品的類型和數量、試驗設計（包括組內組間因素)、驗證參數和參數的可接受標準以及數據分析規范等內容。

驗證用樣品從日常檢測該項目的樣品中隨機選擇，并確保能代表整體物料的特性。樣品制備應在驗證序列中單獨進行。

生物測定方法中的某些操作因素（溫度、酸度、培養時間等）可能導致測量的組間變異，這些因素通常在研發階段通過實驗設計（動物數量、稀釋數量、每個稀釋度的平行測定、稀釋間距等）的可接受標準和數據統計分析來進行評估。試驗設計應考慮測量流程的所有變異源因素，包括取樣、樣品制備、組內和組間因素，使用交叉或嵌套的實驗設計來揭示變異的重要來源,保證長期條件下變異具有代表性。

關于驗證可接受標準的設定，如果目前存在質量規范的產品，可接受標準應基于測量值可能落在產品規范范圍外的風險進行判斷和設定。可使用過程能力指數來獲悉偏差和中間精密度的邊界。中凈環球凈化可提供生物實驗室、微生物實驗室、細胞實驗室、凈化工程等的咨詢、規劃、設計、施工、安裝改造等配套服務。

生物學測定方法驗證結果應記錄在驗證報告中。驗證報告應支持方法適用于預期使用目的的結論或指明糾正行動。報告應包括研究的原始數據和統計學運算。驗證數據的深入分析包括圖解和統計摘要,指出驗證參數和他們與目標可接受標準的一致性。

（4）生物學檢測方法的驗證

生物學性質測定方法驗證的主要指南包括:

FDA 工業指南  生物制品分析規程及方法驗證;

原CFDA CDE 生物制品質量控制分析方法驗證技術審評一般原則。

①專屬性    生物學測定方法的專屬性與測定方法及產品組成密切相關所以應從測試原理、測試用材料和供試品組成等方面分析方法的專屬性。

如采用免疫印跡試驗進行生物制品的鑒別，應首先對所使用抗體的特異性進行分析;若供試品中還存在其他組分，則應進一步驗證被檢測物中其他物質能否引起非特異性免疫反應。

如采用細胞測定方法檢測生物活性，應首先說明被測物質與特定的細胞應答之間的相關性。為表明細胞測定方法的特異性，可進行相關試驗進行驗證，如加入抗體或特異抑制劑的封閉實驗等。如果成品中加入了可能影響活性測定的輔料，應進行相關驗證以排除此種影響。

如采用 ELISA 法檢測重組產品的殘余宿主蛋白含量，可采用與表達體系相同的宿主細胞的蛋白作為免疫原制備抗體，若采用與產品相似工藝進行處理后再免疫動物，則所獲得抗體的特異性更好。另外，產品中存在的大量目的蛋白可能影響宿主蛋白的測定，應進行相關驗證以排除此種影響。

②準確度    生物制品的生物學活性為相對活性，一般與同時進行測定的標準品/參考品進行比較而得，所以應對單位有一個適當的定義或以適用的標準品/參考品作為對照經計算而得。為得到準確的測定結果,應注意以下幾點。

a.必須同時測定供試品和標準品/參考品的劑量反應曲線，而且兩條曲線必須具有平行性。

b.應盡可能使供試品隨機分布及保證測試系統的平衡性。需對引起系統偏差的某些因素進行分析排除，如不同的試驗平板、平板的不同位置（如邊緣效應)、檢測次序、動物實驗中的籠子效應等。

以相對效價測定方法為例，準確度驗證的范圍應包括方法日常使用的范圍;可信賴的準確度評估需要測定范圍內至少3個效價水平，推薦5個效價水平的評估;最常用的方式是通過稀釋標準物質或已知效價的樣品獲取目標標效，這種類型的方法經常被稱為稀釋線性試驗。

③精密度    由于各種生物活性測定方法的變異均較大，所以精密度往往不太理想。

重復性的驗證，建議在期望的濃度范圍內至少選取三個濃度水平，每個濃度至少應測定5次,求得每個濃度水平的精密度。

對于不同測定方法，其精密度可有較大不同，一般情況下，酶法:小于20%;結合試驗:小于20%;細胞試驗:小于30%:動物試驗:小于50%。對于一些尚不成熟的試驗方法或某些特殊方法（如珀斑試驗)，其方法變異可能會更大些。

④線性    線性關系一般是指檢測結果與樣品含量的直線相關性，而且一般情況下線性關系是定量測定的基礎，所以應盡可能摸索出存在較好線性關系的測定方法并進行線性驗證。

線性可以直接對標準品、供試品進行測定。為了建立線性關系，建議至少要用5個濃度點，每一濃度測定3次，每次重復測定3份，用這些結果計算響應值與被分析物的濃度的比例關系,或通過定義明確的數學計算形成比例關系。

某些生物活性測定方法線性范圍較小（如細胞測定中呈S曲線)，采用曲線擬合的方法應更合理。

應提供相關系數、Y軸上的截距、回歸線的斜率等數據，還可以分析實測值與回歸線的偏差（離散性)，以助于對線性作出評價。

⑤范圍    具體的范圍一般根據檢測的目的而設定。驗證時所設定的范圍應至少包括了產品規范中的范圍，如標準中規定成品生物活性應為標示量的80 %～120%，則驗證的范圍可設定為標示量的70%～130%。

對于生物制品的生物活性測定而言，精密度、線性和范圍是非常重要的驗證參數。為減少驗證工作的繁雜性，可將范圍研究與精密度、線性研究合并進行。

⑥耐用性    由于生物學測定結果對分析條件往往比較敏感，所以方法的耐用性驗證非常重要,根據具體情況,可針對關鍵的參數進行耐用性驗證。

耐用性是通過有效地改變實驗方法的參數，來測定此改變對試驗結果的影響，即實驗結果不受影響的承受程度。在每種試驗條件下，對準確性、精密性或其他參數進行測定，以確定試驗方法的耐受或承受能力。在研制階段即應進行耐用性的評估，它應能表明在方法的參數有微小改變時該分析方法仍然是可靠的。

⑦檢測限度和定量限度    對于已建立的雜質檢測方法，應進行檢測限和定量限驗證。檢測限和定量限可以通過直觀法、信噪比法等測定。

（5）案例分析

下表為相對效價測定方法驗證案例,僅供參考。

相對效價測定方法驗證案例

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